Enzymologie
I. Une nécessité : le catalyseur – enzyme
les réactions chimiques sont régit par la loi
d’action de masse : A + B --> C + D
[C].[D]
Keq = ---------
[A].[B]
Exemple : 2 CO2 --> 2 CO + O2.
Cependant, les réactions sont très lentes et la vie serait
impossible sans la présence de catalyseurs.
|
A.
Les
catalyseurs |
 |
B. Nomination des enzymes
En général, on utilise le suffixe –ase. Si l’enzyme a une fonction spéciale :
|
Graisse |
--> |
Lipase |
| Amidon | --> | Amylase |
| Oxydation | --> | Oxydase |
| Déshydrogénation | --> | Déshydrogénase |
| Décarboxylation | --> | Décarboxylase |
Le nom d'un enzyme est en deux parties :
-
nom du substrat
- type de réaction catalyser (se termine par "ase")
exemple : héxokinase : ATP + D-hexose --> D-hexose-6-P + ADP.
L’hexokinase est appelée : ATP D-hexose phosphotransférase.
II. Fonctionnement d’une enzyme
Ce sont des protéines de grande taille qui possède une région
spécifique de catalyse : le site actif.
Les acides aminés des enzymes participent à la fixation du
substrat et maintiennent la structure tridimensionnelle. Ce sont
les changements de types de liaison (ionique, Van der Waals) qui
permettent la catalyse. A la fin de la réaction, il y a un
retour à l’état initial.
S’il y a une délétion d’un acide aminé au niveau du site actif,
l’enzyme ne fonctionne plus. Mais si cette délétion est proche
du site actif, il peut y avoir une baisse de l’activité
enzymatique. Les conséquences varient selon la localisation de
la mutation.
Parfois, les enzymes ont besoin de la présence de métaux rares
proches de leur site actif pour fonctionner correctement.
Certaines ne peuvent avoir d’activité catabolique qu’en présence
d’une coenzyme.
Système complet : holoenzyme = apoenzyme (l’enzyme proprement
dite) + coenzyme.
La coenzyme peut être reliée par une liaison faible (le plus
souvent, ionique, Van der Waals) ou par une liaison covalente.
Dans le cas de liaisons faibles la coenzyme est considéré comme
un cosubstrat.
Exemple : rôle important en anaérobie.
Coenzyme : lacticodéshydrogénase.
III.
les grandes familles de coenzyme
A.
facteurs coenzymatique à structure
nucléotidique
l’ATP est une source d’énergie facilement utilisable. Mais elle
joue aussi le rôle de transporteur de phosphore dans
l’activation des sucres (oses) et des aminoacides. C’est
quasiment un cosubstrat :
ATP + R–OH R–OP + ADP.
B.
nucléotide complexe
B.1. Coenzymes pyrimidiques
dérivée de la vitamine PP (amide nicotinique) antipellagreuse.
Elles servent de transporteur d’hydrogène avec :
NAD : nicotinamide dinucléotide (= niacine).
NADP.
B.2. Enzymes
flaviniques
dérivée de la vitamine B2 : la riboflavine. Elles servent de
transporteurs d’hydrogène (par exemple : dans le cycle de
Krebs).
Ce sont :
-FMN : Flavine Mono Nucléotide.
-FAD : Flavine Adénine Dinucléotide.
B.3. ACP : Acyl Carrier Protein
ce sont des activateurs de la synthèse des acides gras. Ils sont
dérivés de l’acide pantothénique.
B.4. La coenzyme A (CoA)
dérivée de l’acide pantothénique (la vitamine B5). Elles
activent les acides gras :
Vit. B5 + Cystéine amine + ADP --> CoA.
B.5. la méthyl cobalamine /
5’désoxyadénine cobalamine
elles sont dérivées de la vitamine B12. leur rôle est de
participer aux transferts de radicaux méthyl. Elles sont souvent
associées à une autre coenzyme, la THF (Tétra Hydro Folate) :
elle permet le passage du méthyl-malonylCoA au succinylCoA. Elle
est dérivée de l’acide folique. Le folate permet le transport et
l’interconversion des radicaux monocarbonés (méthyl, formyl,…).
Une carence en folate entraînera une anémie mégaloblastique.
la B12 participe à la synthèse de bases puriques.
Exemple clinique :
Une gastrite se traduit par un déficit en facteurs intrinsèques.
Il existe donc un problème d’absorption de B12 donc une carence
en folate et donc une anémie mégaloblastique. Il faut alors
injecter la B12 pour corriger l’anomalie (étant donné que la
prise de médicament per os sera inutile).
Déficit en vitamine B12 (ou en
tétrahydrofolate)
Ce n'est pad dû à une carence alimentaire mais la vit B12
apportée par l'alimentation n'est pas absorbée. Normalement, il
existe une protéïne : le facteur intraséque, secretée par la
paroi de l'estomac qui permet quand elle est liée à la vit B12
sont absorption dans l'iléon. Chez certains sujets ayant des
gastrites chroniques, ils ne sécrétent plus de facteur
intrasèque donc la vit B12 n'est plus absorbée. Par conséquence
cette réaction n'est plus catalysée, on ne peut plus methyler
les uraciles en thymine ce qui va donner une baisse du nombre de
division cellulaire et présence de grosses molécules
(=mégaloblastes)=>Anémie mégaloblastique
B.6. dérivé
de la vitamine B6
ce sont les pyridoxine, pyridoxal phosphate et pyridoxamine. Ils
interviennent dans les réactions de désamination et de
transamination
C.
les
coenzymes dans les réactions de carboxylation
C.1. les dérivés de la vitamine B1
(thiamine pyrophosphate)
ils interviennent dans les réactions de décarboxylation :
C.2. la biotine (B8) permet la
carboxylation
C.3. l’acide lipoïque
c’est un transporteur d’hydrogène, lorsque le pont S–S s’ouvre :
il est impliqué dans la décarboxylation oxydative de l’acide pyruvique et de l’acide α-cétoglutarique.
IV.
Notion de Vitamine
ce sont des substances azotées indispensables à la vie. Elles
doivent être fournies en petites quantités de façon continue,
pour un fonctionnement normal de l’organisme.
On est incapable de les synthétiser nous même, il nous faut
donc les importer grâce à notre alimentation. Ce sont souvent
des coenzymes.
V.
Cinétique enzymatique
A.
Notion de produit et de
substrat
| A | --> | B + C (par exemple : clivage catabolique) |
| A+B | --> | C + D (échange de groupe) |
| A+B | --> | C (synthèse) |
|
Substrat(s). Il se lie à l’enzyme. Plusieurs substrats possibles |
--> |
Produit(s). Parfois plusieurs produits. |
Les enzymes sont présentes en
très petites quantités. La quantification de ces molécules est
donc très difficile. Heureusement, l’activité catalytique des
enzymes nous fournit un moyen sensible et spécifique pour les
mesures de la vitesse de la réaction catalysé par cette enzyme.
La vitesse est d’ailleurs souvent proportionnelle à la quantité
d’enzyme présente.
On mesure soit la disparition du substrat, soit l’apparition du
produit. On effectue des mesures colorimétriques à l’aide d’un
spectromètre selon la loi de Berre Lambert :
DO = Σcl.
DO : densité optique (sans unité). Σ : coefficient d’extinction molaire.
c : la concentration. l : longueur du trajet optique.
On utilise souvent comme unité le katal : c’est l’apparition d’1
mole de substrat à 30°C
λ doit avoir la longueur d’onde d’absorption maximum.
|
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I0 < I1 |
On fait ensuite une courbe d’étalonnage en prenant des valeurs connues :
|
On mesure la densité optique sur le photospectromètre qui correspond sur la courbe à une concentration α d’un produit. |
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Plusieurs facteurs vont affecter la réaction :
-la
concentration du substrat. |
|
La vitesse dépend de la quantité d’enzyme présente. |
|
Inhibition
Il existe deux types d’inhibition :
-compétitive.
-non-compétitive
I.
Inhibition compétitive
Dans ce cas, la structure chimique de l’inhibiteur (Ih) est très
voisine de celle du substrat (S). L’Ih va concurrencer S et
prendre sa place pour former un complexe irréversible avec
l’enzyme (IhE).
Par exemple : inhibition de la succinodéshydrogénase.
Le malonate est une molécule de structure voisine du succinate
qui ne peut pas être déshydrogénée.
k1
[Enz] [lh] k1
Enz lh <-> Enz-lh donc kih = ------------- = ----
k-1
[Enzlh] k-1
Si l’inhibiteur se lie très
fortement à l’enzyme (Kih petit), il restera peu d’enzyme pour
se lier au substrat et la vitesse de formation du produit sera
ralentie : c’est l’inhibition.
Si l’on rajoute du substrat dans le milieu réactif (sans changer la
concentration de Ih), il y aura donc un peu plus de substrat, et
la probabilité que l’enzyme se combine à S plutôt qu’à Ih
augmente. Donc la vitesse de réaction augmentera aussi.
Si l’on augmente la quantité de substrat de façon telle que les
complexes EnzIh deviennent négligeables devant EnzS, la Vmax
pourra alors être atteinte, bien que la quantité d’enzyme reste
constante.
Nous voyons donc que la présence de l’inhibiteur compétitif diminue
l’affinité de E pour S par compétition sur le site actif.
Donc lors dune inhibition compétitive, la Vmax peut être conservée
pour une même quantité d’enzyme et le Km mesuré :
[lh]
Km' = k ( 1 + -------)
Kih
Le problème réside donc dans la concentration de l’inhibiteur et dans la valeur de son Km : le Kih.
Exemple :
Le formol est toxique pour le SNC et peut
provoquer un état de cécité irréversible. Pour éviter cela, on
injecte une grande quantité d’éthanol pour prendre la place du
méthanol sur l’alcool déshydrogénase afin de permettre
l’élimination urinaire du méthanol action thérapeutique.
Ce cas est spécial, car l’éthanol est certes un inhibiteur
compétitif de méthanol sur l’alcool déshydrogénase, mais
normalement cette enzyme catalyse le passage du glycérol en
glycéraldéhyde.
II.
Inhibition non-compétitive
Dans ce cas là, l’inhibiteur n’est pas une substance voisine du
substrat. Une augmentation de la concentration de S n’empêchera
pas l’inhibition dans la mesure où le site de fixation de Ih sur
l’enzyme sera différent de celui de S :
-
un site pour Ih.
-
un site pour S.
=> Pas de compétition possible.
En effet le substrat peut toujours se lier à l’enzyme, malgré
cela la réaction ne se fait pas. Cela induit une chute de la
vitesse de réaction (Vmax ne sera jamais atteinte) mais
néanmoins le Km est conservé (Car l’enzyme complexée existe
toujours).
1 1
lh
---- + ----
( 1 + ------ )
Vmax' Vmax
Kih
Dans ce mode d’inhibition, une fixation de
l’inhibiteur de manière irréversible est possible : l’enzyme
n’est alors plus du tout utilisable.
III.
Représentations de Lineweaver-Burke
Régulation de l'activité enzymatique
I. Régulation à taux d’enzyme constant
il peut y avoir des modifications liées à des:
- activateurs ou inhibiteurs allostériques.
- modifications covalentes réversibles.
- autres modifications non-covalentes.
A.
Modifications liées à des activateurs ou
inhibiteurs allostériques
De faibles variations de substrat peuvent engendrer un grand
nombre de variations de vitesse. L’activité des enzymes est
modulée par des effecteurs allostériques (ni la structure du
substrat, ni celle du produit).
Ces effecteurs sont soit activateur, soit inhibiteur. Les
effecteurs de type inhibiteur sont souvent rencontrés dans les
phases de régulation appelées rétroinhibition (≠ rétrorégulation)
:
|
|
E n’a plus de
parenté structurale avec A. On dit qu’il inhibe
allostériquement la première enzyme. Cette inhibition est dite rétroinhibition. C’est différent de ce que l’on appelle rétrorégulation où il y a modification du taux de l’enzyme. |
Exemple :
Il existe deux
types d’enzymes allostériques
• celles dont la vitesse maximale peut être atteinte en
augmentant la quantité de substrat, même en présence
d’inhibiteur => système K.
• celles avec lesquelles ce phénomène ne se produit pas => le
système V.
Cela n’a rien à voir avec la cinétique
Michaellienne.
Les enzymes du système K : du point de vue moléculaire, ce sont des enzymes multimériques formées de plusieurs sous-unité (4) identiques
|
|
Son fonctionnement repose sur le principe de
coopérativité : le fait q’un 1er substrat se fixe à
l’enzyme, favorisera la fixation d’un 2nd substrat (sur un
des 3 autres sites) et ainsi de suite jusqu’à ce que les 4
sites soient fixés. L’effet homotrope de l’enzyme : il n’y a jamais de compétition entre le substrat et l’inhibiteur dans le système allostérique (même dans le système K). |
il existe deux théories :
1) le modèle de Monod, Wyman et Changeux :
ce modèle suppose l’existence de deux formes isomères
interconvertibles de chacune des sous-unités :
-T pour tendu
-R pour relâché…
cela reflète les changements de structures quaternaires des
protéines constituants les sous-unités
On émet un postulat de symétrie et de conservation de symétrie :
Dans ce modèle, le substrat ne se fixe que sur R. si l’on ajoute à ce postulat, la loi d’action de masse :
RS <---> R <--->T
On peut expliquer l’effet homotrope positif (un S
qui se fixe, favorise la fixation d’un autre S), mais on ne peut
pas expliquer une coopérativité négative (la fixation d’un S
empêche la fixation d’autres S).
=> D’où la nécessité d’un autre modèle.
2)
le modèle de Khosland :
il n’y a pas de postulat de symétrie et c’est la fixation de S
qui entraîne le passage de T à R :
ce système dit séquentiel mathématique, est plus
complexe, mais il a l’avantage d’expliquer la coopérativité
négative (fixation de S sur E diminue les fixations des autres S
sur E).
=> La régulation de type allostérique permet une activité
enzymatique à débit constant.
1.2) Modifications covalentes réversibles
:
Il s’agit des phénomènes de phosphorylation, déphosphorylation.
L’une active l’enzyme, l’autre la désactive (pas toujours le
même rôle).
La phosphorylation du glycogène en glucose-6-P est le fait d’une
enzyme qui peut être sous deux formes : forme A : active. Forme
B : inactive.
Le passage de A à B est due à l’ajout sur deux sérine de
l’enzyme de deux groupements phosphates. Cela se faisant grâce à
une cascade de protéine kinase a qui est AMPc dépendante
(tyrosine kinase, sérine kinase).
2 phosphorylase b + 4 ATP <---> phosphorylase a + 4 ADP.
L’effet inverse
se fait grâce à une phosphatase.
Il existe deux familles de kinases :
-sérine kinase.
-tyrosine kinase : elle phosphoryle la protéine cible sur une tyrosine.
Parfois dans une même enzyme, il peut y avoir les deux systèmes
de régulation
B.
Modulations
d’activité par modifications non-covalentes
Ce type de modulation est plus rare et met en jeu des liaisons
de type faible.
C. Cas de l'actalbumine
|
|
Dans la plupart des cellules, il y a une enzyme : la galactoside transférase, son rôle est de transférer un sucre : le galactose, sur un autre sucre : N-acétyl-glucosamine. |
A la fin de la grossesse, l’hypophyse produit une hormone : la prolactine. Cette hormone déclenche la lactation par la synthèse de l’α-lactalbumine
Cette enzyme peut s’associer à la galactoside
transférase par des liaisons non-covalentes pour en modifier
l’action : au lieu de changer le galactose en
N-acétyl-glucosamine, elle fait transférer le galactose sur du
glucose pour former du lactose : le sucre du lait.
Avec ce système, on modifie le taux d’activité enzymatique sans
faire varier :
-la synthèse de l’enzyme (augmentation ou diminution de la
synthèse)
-son taux de dégradation (pas d’accélération ou de ralentissement).
Ces phénomènes vont être plus lents à s’installer que ceux de
phosphorylation qui peuvent être quasi-instantanés.
La présence d’un composé peut inhiber l’HNG-CoA réductase : une
enzyme clé dans la synthèse du cholestérol => rétrorégulation.
D.
Cas particulier :
conversion des proenzymes en enzyme active.
protéine sans activité qui après avoir subit une protéolyse vont
devenir actif en révélant leur site actif. Cette transformation
est irréversible :
-les protéases digestives.
-les enzymes de la coagulation du sang.
-la digestion des caillots sanguins.
Chymotrypsinogène => chymotrypsine
 |
La sécrétion sous forme inactive permet la protection des tissus qui pourraient être attaqués par la forme active de ces enzymes protéolytiques. |
II. Dosage d’activité enzymatique en médecine
A.
mise en évidence d’activité dans
le plasma.
B.
mise en évidence d’une pathologie métabolique.
Notion d’isoenzyme (= isozyme) : a l’origine cela
représentait tous les enzymes qui catalysaient la même réaction
chimique.
En fait, c’est différentes formes d’enzymes formées de
protomères différents pouvant se combiner entre eux pour former
une enzyme active.
Exemple : la lacticodéshydrogénase ou LDH :
Cette enzyme est formée de 4 protomères (sous-unité)
qui peuvent être de deux types :
-le type H pour le cœur (Heart).
-le type M pour les muscles.
D'ou les combinaisons possibles:
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H H H H |
Cœur. |
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H H H M |
Autres. Organes. |
|
H H M M |
|
|
H M M M |
|
|
M M M M |
Foie et muscles. |
Courbe de dénaturation thermique :
|
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S’il
existe une cassure de la courbe de dénaturation en fonction
du temps il y a plusieurs protomères. Ici, il y a 2 pentes, nous sommes donc en présence de deux types d’enzymes : deux isoenzymes (ici : α-HBDH et 4H). Leur intérêt est qu’elles sont spécifiques d’organes. Quand l’enzyme est anormalement présente dans le plasma, c’est qu’un organe est atteint. Avec un dosage, on identifie le type de l’isoenzyme ce qui nous révèle le type d’organe atteint. |
La plupart du temps ces enzymes sont absentes du plasma (ou alors a un taux très faible donc non-significatif).
Enzymes couramment dosées :
*
Aspartate
aminotransférase GOT (enzymes intracellulaires) :
Elle transfert un groupement amine d’un acide aminé vers un
α-cétonique (utilise le pyridoxal phosphate comme enzyme :
dérivé de la B6) : aspartate + α-cétoglutarate => glutamate +
oxaloacétate.
* Alanine aminotransférase GPT
(plutôt dans le tissu hépatique) :
Alanine + α-cétoglutarate => glutamate + pyruvate.
* La transaminase GOT
(prédominant sur GPT) : elle est importante dans le tissu
myocardique, on la retrouve dans le sang après un infarctus (les
cellules vont souffrir et mourir en déversant leurs
transaminases dans le sang).
Ce système fonctionne aussi pour le foie avec le passage dans le
sang d’enzymes hépatiques (prédominance de GPT sur GOT).
Ainsi la lacticodéshydrogénase n’est pas présente dans le sang
en temps normal, le cas contraire trahit une affectation
myocardique (ou musculaire suivant l’isozyme).
Les taux en temps normal sont faibles 5 à 35 unités. Après un
infarctus on détecte parfois plus de 1000 unités (100 pour la
lacticodéshydrogénase).
* La créatine phosphokinase (CPK)
: c’est une enzyme à taux très faible dans le plasma, elle va
fortement augmenter en cas de lésion musculaire.
Il en existe des isoenzymes :
- chaîne de type M.
- chaîne de type B (Brain).
D’où : -CK MM.
-CK BB.
-CK MB (spécifique du myocarde) : dosage en cas d’infarctus car
elle passe dans le sang de façon très précoce :
Créatine + ATP => créatine phosphate + ADP.
* La γ-glutamine transpeptidase : γ-GT
:
Normalement sa concentration plasmatique est très faible. Elle
est synthétisée dans les voies biliaires. Mais est inductible
par l’alcool éthylique.
Si le taux de γ-GT est élevé, il ne faut pas soupçonner
précocement l’alcoolisme mais également une pathologie des vois
biliaires, ou l’inverse.
* Enzyme particulière : une
enzyme alcaline la 5’nucléotidase.
Si le taux de γ-GT est élevé, ainsi que celui de la
5’nucléotidase => pathologie biliaire.
En revanche, s’il n’y a que les γ-GT avec un taux élevé =>
alcoolisme…peut-être !…
* Dosage des phosphatases :
-alcaline (pH basique) : elle passe dans le sang lors de
pathologie biliaire (5’nucléotidase) ou osseuse.
-acide (pH acide) : ce dosage de phosphatase acide est
spécifique lors de soupçons d’une pathologie prostatique
* deux enzymes sécrétées par le
pancréas exocrine :
-lipase pancréatique (via le duodénum) : hydrolyse des
lipides alimentaires préalablement émulsionnés par la bile afin
de permettre leur absorption.
-amylase pancréatique : digère l’amidon un polymère du
glucose (en α 1-->4).
Lors de pancréatite : il y a une inflammation, car l’enzyme
active a été libérée sur son lieu de production -->
autodigestion du pancréas --> très fortes douleurs violentes
abdominales.
REPRODUCTION COMPLETE OU PARTIELLE INTERDITE