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L'apoptose / nécrose
I. Introduction - généralités
L'apoptose représente une forme de
mort cellulaire qui dépend de l'activation d'une machinerie
interne à la cellule et requiert l'activation de gènes et une
synthèse protéique de novo dans la plupart des cas. Elle
s'oppose à la mort par nécrose résultant d'une destruction des
cellules par des facteurs exogènes physiques, chimiques ou
biologiques, qui provoquent la lyse des cellules et la
dispersion de leurs constituants dans l'environnement
extracellulaire. Ce «suicide cellulaire» est sous-tendu par un
programme génétique activé par défaut dans les cellules
privées des signaux de survie appropriés émis par son
environnement.
L'apoptose est un mécanisme universel des êtres vivants, uni
ou pluricellulaires. Chez les métazoaires, l'apoptose
représente le mécanisme fondamental, qui de façon permanente
contrôle l'homéostasie, l'intégrité et les fonctions des
cellules. Au cours du développement de l'embryon la
morphogénèse des organes dépend de l'élimination massive de
certaines ébauches selon un mécanisme apoptotique. C'est le
cas par exemple de l'évidement des tractus à partir de cordons
pleins, de la formation des espaces interdigitaux ou de la
régression des ébauches urogénitales au cours de la
différentiation sexuelle. Dans le système nerveux central les
neurones générés en excès qui ne peuvent établir de connexions
fonctionnelles et ne reçoive pas de signaux de survie de leurs
homologues sont éliminés par apoptose.
L'apoptose participe également au renouvellement des tissus en croissance, à l'évolution cyclique des tissus soumis à des variations hormonales (épithélium mammaire, muqueuse utérine), et à l'élimination les cellules sénescentes, surnuméraires ou anormales (infectées par un virus, altérées par des lésions du génome ou des dysfonctionnements métaboliques). Elle constitue également un mécanisme fondamental du fonctionnement du système immunitaire qui élimine les clones de lymphocytes auto-réactifs.
Depuis ces dix dernières années une dérégulation de l'apoptose a été impliquée dans de nombreux processus pathologiques, soit par activation excessive comme dans les maladies neurodégénératives (maladie d'Alzheimer), les lésions ischémiques neurologiques - ou cardiaques et les atteintes virales (hépatite et sida), soit par défaut d'intervention conduisant au développement de tumeurs malignes.
II. Aspects cellulaires de l'apoptose : apoptose vs nécrose
| Caractéristique | Nécrose | Apoptose |
|
Conditions de survenue |
brutale | programmée |
| Mode | passif | actif (ATP dépendante) |
| Vitesse de déroulement | rapide | lente |
| Cicatrisation | groupe de cellules | cellules isolées |
| Incidence | Pahologique : ischémie sévère, hyperthermie sévère |
Physiologique : morphogenèse,
homéostasie du tiss, involtion, métamorphose Pathologique : cancer, radiations ionisantes, hyperthermie moyenne, immunité cellulaire |
| Morphologie | rupture de la membrane cellulaire et désintégration des organites intracellulaires, inflammation due au relargage du contenu intracellulaire, phagocytose des débris cellulaires par les monocytes | margination de la chromatine et condensation du cytoplasme, fragmentation en corps apoptotiques sans relargage du contenu intracellulaire, phagocytose des corps apoptotiques par les cellules voisines |
| Lyse de la membrane plasmique | première étape | dernière étape |
| Hydrolyse de l'ADN | dernière étape | première étape |
| Volume cellulaire | augmentée | diminuée |
| Densité cellulaire | diminuée | augmentée |
| Concentration calcique | diminuée | augmentée |
| Organites intracellulaires | lysés | "intacts" |
| Cible | groupe de cellules | cellules isolées |
L'apoptose, processus actif génétiquement régulé, se distingue classiquement de la nécrose qui résulte d'une destruction pathologique passive des cellules. Il faut souligner cependant que ces deux formes de mort cellulaire ne sont pas exclusives. Le déroulement de l'apoptose en réponse à des conditions subléthales nécessitant un métabolisme énergétique préservé, l'épuisement des réserves en A TP en cas d'aggravation des lésions peut précipiter la mort nécrotique des cellules. C'est le cas des l'infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux: l'ischémie provoque une nécrose de la zone centrale des tissus atteints; cette zone est entourée d'une couronne de tissu dit « à risque» qui peut selon l'évolution des troubles vasculaires (et le traitement) évoluer vers la restauration, l' apoptose ou la nécrose.
La nécrose se caractérise essentiellement par la destruction massive et rapide des populations cellulaires par lyse osmotique: une entrée massive d'eau secondaire à l'arrêt de l'activité des pompes membranaires provoquent un gonflement des cellules suivie d'une rupture des membranes,. de la destruction des organites et de la libération du contenu cellulaire (en particulier des enzymes lytiques) dans l'espace extracellulaire. Cette lyse déclenche une réponse inflammatoire qui accentue les lésions tissulaires. Le parenchyme détruit est secondairement remplacé par un tissu cicatriciel inerte.
L'apoptose au contraire élimine sélectivement les cellules, provoque une condensation de la cellule et préserve l'intégrité des organites et des macromolécules jusqu'à un stade avancé. L'ensemble du processus apoptotique se déroule sur plusieurs heures et n'induit pas de réponse inflammatoire.
-
La réduction du volume cellulaire est une des premières modifications morphologiques dues à l'apoptose. Le cytoplasme se condense, la cellule s'arrondit et perd ses contacts avec les cellules voisines. Ces aspects morphologiques résultent d'altérations biochimiques précoces affectant membranes et cytoplasme. La condensation de la cellule est associée à la formation de liaisons croisées entre les protéines sous l'action de transglutaminases qui rigidifie le cytoplasme et contribue à sa deshydratation. Certains lipides comme la phosphatidyl-sérine sont transloqués de la face interne à la face externe de la membrane plamique. Ce phénomène affecte également une protéine l'annexine V. La détection de cette dernière à la surface des cellules par immunohisto/ctyochimie est actuellement utilisée pour marquer les cellules en apoptose.
-
L'apoptose provoque des modifications caractéristiques du noyau. La chromatine se condense à la périphérie du noyau (marginalisation) puis se fragmente en petits amas entourés de fragments d'enveloppe. Ces modifications nucléaires s'accompagnent du clivage de l'ADN au niveau des régions internucléosomales, qui libère des fragments dont les tailles sont des multiples de celle du nucléosome, soit 180-200 paires de bases. Ce phénomène est la conséquence de la préservation histones qui protégent l'ADN du nucléosome de l'attaque nucléasique. Dans la cellule en nécrose au contraire la lyse rapide des protéines détruit le nucléosome. L'ADN est donc clivé par les nombreuses DNAses libérées en fragments de tailles aléatoires. Cette différence est mise à profit pour identifier la présence de cellules en àpoptose par l'aspect du profil de migration électrophorétique de l'ADN dans un gel d'agarose. L'ADN de haut poids moléculaire de cellules intactes ne pouvant migrer dans le gel il forme en haut du gel une bande épaisse colorée intensément par le bromure d'éthidium. Les petits fragments d'ADN de tailles aléatoires des cellules nécrotiques migrent de façon diffuse et forment une piste homogène du haut en bas du gel. L'ADN des cellules en apoptose présente un aspect dit en « échelle », caractérisé par la présence de bandes dont les tailles sont des multiples de 180-200 pb, qui résultent du clivage plus ou moins
extensif de fragments de nucléosomes. Il est également possible
d'identifier les cellules en apoptose en microscopie par la détection du phénomène de clivage de l'ADN. La DNASE apoptotique (contrairement
aux DNASES non spécifiques agissant lors de la nécrose) clive l'ADN dè'
chaque côté du nucléosome de façon asymétrique, en créant une extrémité 3'OH saillante sur laquelle peuvent être fixés des dNTP par l'enzyme TdT (Terminal Deoxynucleotide Transferase). Ce principe est utilisé dans le test de marquage dit TUNEL (Terminal dUTP Nick End Labelling) dans lequel les extrémités 3 'OH des coupures sont marquées par des molécules de dUTP portant un fluorochrome. -
Après la phase de condensation la membrane émet des bourgeonnements qui se détachent pour former les "corps apoptotiques", sacs membranaires entourant des fragments de cytoplasme ou de chromatine. La face externe des membranes des corps apoptotiques présente des molécules externalisées (lipides et glucides) qui sont reconnues comme signaux de phagocytoses par les cellules environnantes qui les éliminent rapidement sans libération du contenu cytoplasmique dans le milieu extracellulaire.
III. Mécanismes moléculaires de l'apoptose
De nombreux composants de la a machinerie apoptotique sont produits de façon constitutive par la plupart des cellules sous formes inactives, et leur activation dépend de l'équilibre entre les facteurs activateurset les facteurs inhibiteurs.
Le déroulement de l'apoptose s'effectue schématiquement en 2
phases :
-
la phase de déclenchement ou d'engagement survenant en réponse à un~
signal intrinsèque ou extrinsèque. -
la phase d'exécution au cours de laquelle sont activées des enzymes qui
dégradent les substrats cellulaires provoquant la mort apoptotique. Les
enzymes majeures de cette étape sont appelées CASPASES.
Ces deux phases sont contrôlées par des protéines codées par
de nombreux gènes de régulation aux effets pro ou
antiapoptotiques. Enfm il faut souligner l'importance
stratégique des mitochondries qui sont les organites clefs de
l'apoptose, au carrefour des voies d'exécution et de
régulation.
A.
La
phase de déclenchement ou d'engagement
La machinerie apoptotique peut être activée par deux voies
différentes mais interconnectées: la voie extrinsèque qui
dépend de l'activation de récepteurs membranaires par des
ligands spécifiques, et la voie intrinsèque ou mitochondriale
A.1. La voie des
récepteurs de mort cellulaire
Cette voie est particulièrement importante dans les phénomènes
apoptotiques physiologiques, en particulier dans la
destruction des lymphocytes auto-réactifs, l'élimination des
cellules infectées par un virus ou des cellules tumorales par
les cellules immunitaires cytotoxiques. Elle implique des
protéines transmembranaires positionnées à la surface de la
cellule: ce sont les récepteurs de mort cellulaire. Ces
récepteurs sont capables d'induire la cascade apoptotique
lorsqu'ils fixent les ligands appropriés par l'intermédiaire
de protéines adaptatrices qui recrutent et activent des
caspases.
Les récepteurs de mort cellulaire appartiennent à la
superfamille du TNFR (Tumor Necrosis Factor Receptor). Sept
membres de cette
famille ont été identifiés dont le mieux connu est le récepteur
FAS (ou CDC95) qui fixe le ligand FAS-L. Ces récepteurs sont
des protéines transmembranaires de quelques centaines d'acides
aminés qui après fixation de leurs ligands par leur extrémité
extracellulaire N-terminale sont activés sous forme de
trimères. L'extrémité intracellulaire C-terminale comporte une
séquence de 80 acides aminées hautement conservée formant un
«domaine de mort» (Death Domain ou DD).
Dans le cas de FAS les trois DD associés du trimère FAS activé
vont recruter une protéine cytoplasmique appelée FADD (Fas
Associating protein with Death Domain) comportant deux
domaines: un domaine DD qui forme un dimère avec le domaine DD
de F AS, et un domaine DED (Death Effector Domain) qui fixe et
active la procaspase 8 (forme zymogène inactive de la caspase
8).
La caspase 8 dite « initiatrice » va déclencher l'activation
en cascade de nombreuses autres caspases d'aval, dont les
caspases 3, 6 et 7 dites « effectrices ». C'est en définitive
la caspase 3 qui est principalement responsable du clivage
protéolytique des substrats provoquant la mort de la cellule.
Il faut remarquer que FAS peut dans certaines conditions de«
stress» être activé par un mécanisme intracellulaire
indépendant de la fixation du FAS-L.
A.2. La voie
mitochondriale
C'est la voie intrinsèque activée en réponse à un « stress»
cellulaire produit par les radiations ionisantes, l'hypoxie,
l'hyperthermie, les substances toxiques, les radicaux libres,
les lésions du génome ou la suppression des signaux de survie
(hormones, facteurs de croissance, cytokines ).
L'apoptose est déclenchée directement par la libération de
molécules proapoptotiques normalement séquestrées dans
l'espace intermembranaire des mitochondries, dont la plus
importante est le cytochrome c.
Une fois libéré dans le cytosolle cytochrome c s'associe à une
protéine adaptatrice appelée Apaf-1 (Apoptotic Protease
Activating Factor 1) pour former l'apoptosome qui active la
caspase 9, celle-ci activant la caspase 3.
La libération du cytochrome c s'accompagne d'une chute
caractéristique du potentiel transmembranaire des
mitochondries, attestant de la perméabilisation de la membrane
mitochondriale. Ce phénomène est considéré comme marquant une
étape irréversible de l'a poptose (<< point de non retour»).
Les mécanismes de perméabilisation de la membrane externe
restent hypothétiques. Elle pourrait résulter de l'ouverture
du « mégapore » mitochnondrial ou de la formation de nova d'un
canal par des oligomères des protéines proapoptotiques de la
famille Bax (voir plus loin).
Outre le cytochrome c la mitochondrie libère plusieurs autres
facteurs. L'AIF (Apoptosis Inducing Factor) qui migre dans le
noyau et active la fragmentation de la chromatine par une
endonucléase, un répresseur d'inhibiteur des caspases appelé
SMAC (Second Mitochondria-derived Activator of Caspases), des
procaspases et des radicaux libres oxygénés (RLO).
B. La phase d'exécution : les caspases
B.1. Caractéristiques et modes d'activation des caspases
Les caspases (Cystein-ASpartate-specific-ProteASE)
représentent une famille de protéases comprenant actuellement
14 membres, qui tirent leur nom de leur mécanisme d'action.
Leur site catalytique contient une séquence conservée de 5
acides aminés centrés sur une cystéine, et elles clivent leurs
substrats après un résidu aspartate de la région C-terminale.
La spécificité des substrats des différentes caspases dépend
la conformation du site catalytique. Comme la plupart des
protéases, les caspases sont synthétisées sous forme de
zymogènes inactifs ou procaspases. Ces procaspases sont
composées de 3 domaines: un pro domaine aminoterminal et deux
domaines baptisés p20 ou «grande sous-unité» (qui contient le
site actif portant le résidu cystéine) et plO ("petite
sous-unité"). Les séquences pI0 et p20 sont très conservées,
mais celles des prodomaines diffèrent selon les caspases, les
caspases «initiatrices» incluant dans ce pro domaine les
séquences adaptatrices citées plus haut.
L'activation de l'enzyme résulte du. clivage de la procaspase
aux
jonctions prodomaine-p20 et p20-pI0, suivie de la formation
d'un tétramère associant deux domaines pI0 à deux domaines p20
(deux sites catalytiques). Les deux sites de clivages
comportent une séquence de reconnaissance incluant une
cystéine.
Les caspases peuvent être activées par différents mécanismes
selon leur place dans la cascade apoptotique.
-
Clivage par une autre caspase, et activation autocatalytique amplifiant la réponse apopotique en cascade. C'est le mode général d'activation des caspases effectrices.
-
Activation par proximité induite au niveau des complexes récepteurs décrits plus haut (caspase 8).
-
Activation par l'apoptosome (caspase 9).
B.2. Rôles des
caspases dans l'apoptose
Les caspases clivent sélectivement et simultanément un grand nombre de substrats (plusieurs dizaines identifiées actuellement dont les caspases elles mêmes) provoquant en général leur dégradation ou dans certains cas leur activation.
-
Le clivage de la chromatine est catalysé par une nucléase appelée CAD (Caspase Activated Dnase) qui est activée par la caspase 3 qui dégrade sa sous-unité inhibitrice.
-
La fragmentation et le bourgeonnement du noyau résultent principalement de la destruction des lamines par les caspases.
-
La densification et la déformation de la cellule sont associées au clivage des protéines du cytosquelette, dont l'actine, les kératines, la caténine, la fodrine et la gelsoline.
-
Les grands systèmes cellulaires, dont celui de la réparation de l'ADN, sont désorganisés par le clivage de plus d'une dizaine de protéines kinases.
IV. Facteurs de régulation de l'apoptose
L'identificaion des gènes régulant
l'apoptose a bénéficié de l'étude de l'apoptose contrôlant les
populations cellulaires au cours du développement du vers
nématode Caenorhabditis elegans.L'analyse de mutants de l'apoptose
a permis d'identifier des gènes appelés CED (pour "CEll Death)
qui exercent une action pro ou antiapoptotique, et dont les
homologues ont été caractérisés chez les mammifères. De plus
chez l'homme plusieurs de ces gènes ont été découverts à la
suite de l'étude moléculaire de cellules leucémiques dans
lesquelles ils étaient anormalement exprimés.
Les facteurs de régulations peuvent être distingués selon
qu'ils agissent au niveau des mitochondries ou du cytoplasme
(sur les caspases).
Au niveau des mitochondries interviennent les gènes d'importance cruciale de la famille BCL2
Le gène BCL2 (B Celllymphoma 2)
est l'inhibiteUI majeUI de l'apoptose. Il a été identifié chez
l'homme à la suite du clonage du point de cassure d'une
translocation chromosomique l'impliquant dans des cellules
d'un lymphome B. Ont été ensuite clonés successivement une
vingtaine d'autres gènes dont les séquences sont plus ou moins
homologues à celle de BCL2. Les produits de ces gènes sont des
peptides d'environ 200 acides aminés qui possèdent en commun
de 1 à 4 domaines fonctionnels de quelques dizaines d'acides
aminés dénommés BHl-4 (Bc12 Homology) qui leUIs permettent de
former des homo- ou des hétérodimères, ainsi pOUI certains
qu'une séquence d'insertion membranaire à leUI extrémité
N-terminale.
Ces gènes peuvent être classés en deux groupes principaux dont
les produits exercent une action:
"antiapoptotique" : dont Bc12, et Bcl-X (Bc12-relat~d-X) qui
possèdent les quatre domaines BHl-4
"proapoptotiques" : dont Bax (Bcl2-associated- X) et Bak
(Bcl2antagonist-killer) qui possèdent en commun le domaine
BH3, ainsi que plusieUIs autres peptides ne possédant que le
domaine BH3 appelés« BH3 ONLY ».
Les molécules Bc12 et Bcl-X agissent essentiellement sous
formes d' oligomères au niveau des membranes mitochondriales
en bloquant l'action des molécules proapoptotiques de type Bax/Bak:
bcl2 est ancrée dans la membrane mitochondriale externe et
bcl-X y est transloqué à partir du cytoplasme lors de la
réponse antiapoptotique. Bcl2 pourrait également inactiver
plusieurs caspases initiatrices. De plus la séquence
N-terminale permet à ces molécules de s'insérer dans les
membranes du noyau et du réticulum. Bc12 est un inhibiteur
crucial de l'apoptose dont l'action est requise pour assurer
l'homéostasie cellulaire de tous les tissus. il bloque
principalement la voie intrinsèque normalement activée en
réponse à des «stress» tels les radicaux libres ou les
conflits entre programmes de prolifération et de
différentiation (résultant par exemple de l'activation
anormales des oncogènes comme c-myc dans les cellules
malignes). Par ailleurs, plusieurs travaux ont mis en évidence
un rôle anti-oxydant de la protéine Bcl2 : les cellules
surexprimant le gène BCL2 sont plus résistantes à l'apoptose
induite par un stress oxydatif et les souris transgéniques
BCL2 -/- présentent, au cours de la période post-natale, outre
une apoptose massive des cellules lymphoïdes, des troubles
métaboliques directement en rapport avec un stress oxydatif.
La protéine Bcl2 pourrait exercer cette fonction antioxydante
en s'opposant à la production de RLO au niveau mitochondrial.
Cette fonction' antioxydante de Bcl2 renforce l'hypothèse de
l'implication des radicaux libres de l'oxygène dans l'apoptose.
Sa surexpression accélère la cancérogénèse, et il est
considéré comme un oncogène.
-
Les molécules «BH3» jouent le rôle de «capteurs» qui déclenchent l'apoptose en réponse aux signaux internes en neutralisant les facteurs antiapoptotiques dont Bc12. Dans des conditions normales ils sont fixés sous formes inactives sur les structures du cytosquelette (micro tubules, filaments d'actine). L'une de ces molécules appelée Bid (BH3-Interacting Domain) connecte les deux voies de l'apoptose : il est activé à la suite du clivage par la caspase 8, et il induit la formation des complexes Bax/Bak dans la membrane mitochondriale.
-
Les homo-oligomères de Bax et de Bak sont les effecteurs de l'étape mitochondriale. Bax est une molécule cytosolique qui intègre la membrane mitochondriale en apoptose, alors que Bak est une protéine constitutive de cette membrane. Ils forment de volumineux agrégats homologues qui constituent un canal et/ou interagissent avec le «mégapore mitochondrial » appelé «pore de transition de perméabilité de la mitochondrie» (PTP), provoquant ainsi la perméabilisation de la membrane et la fuite des facteurs apototiques retenus dans l'espace intermembranaire.
Les protéines pro et anti apototiques pouvant s'associer pour former des homo ou des hétérodimères, le devenir de la cellule dépend en définitive de leur niveau relatif: par exemple un excès de Bax par rapport au niveau de Bcl2 déterminera un environnement cellulaire favorable à l'exécution de l'apoptose, alors qu'un excès de Bcl2 aura l'effet inverse.
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