Techniques d'étude de l'architecture du noyau
L'étude de l'organisation du noyau cellulaire fait appel à différentes techniques de microscopie pour l'observation des chromosomes et de la chromatine.
I. Le marquage
Deux types de marquage sont utilisés :
-
Sur cellules fixées : c'est essentiellement l'Hybridation In Situ en Fluorescence ou FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) qui détecte les séquences d'ADN par des sondes nucléiques.
-
Sur cellules vivantes : deux types de méthodes sont utilisées
- Le marquage de l'ADN par incorporation en phase S d'analogue
fluorescents des nucléosides (BrdU) ou des nucléosides (dUTP)
- Le marquage de la chromatine par transfert d'un gène
recombinant codant pour une protéine de la chromatine
(histone) et une protéine fluorescente (GFP : Green
Fluorescent Protein) issue d'une anémone de mer.
II. La détection et le traitement
Elle utilise en général la microscopie à fluorescence, les molécules marqueurs étant soit couplées à des fluorochromes (nucléotides, sondes FISH), soit révélées par des anti-corps fluorescents (BrdU), soit naturellement fluorescentes (GFP).
A. Deux types de microscopes sont utilisés : A épifluorescence et confocal.
A.1. Epifluorecence : dans ce type de microscope classique la lumière excitatrice UV (produite par une lampe halogène) qui illumine l'objet et la lumière d'émission produite par l'objet passent toutes les deux par l'objectif. Des filtres permettent de choisir les longueurs d'ondes optimales pour les fluorochromes utilisés. L'objectif transmet la totalité des signaux fluorescents émis par le volume de l'objet, qu'ils soient dans le plan de mise au point (plan focal) ou non, d'où la production d'un important bruit de fond.
A.2. Confocal : Il s'agit d'un microscope conçu pour éliminer ce flou. Dans ce système, seuls les signaux du plan focal sont transmis. La lumière émise passe à travers un diaphragme appelé "trou d'aiguille" qui ne laisse passer que les photons émis par le plan focal. La source lumineuse est un laser fournissant une lumière cohérente qui balaye l'objet selon les axes X et Y, et produit ainsi une séries de coupes optiques. Les photons émis sont captés par des photorécepteurs dont les signaux sont traités par un ordinateur qui assure le traitement de l'image.
B. Le traitement informatique de l'image nécessite l'acquisition d'une image numérique par une caméra CCD ( Charge Coupled Devised) à haute résolution. Les signaux digitalisés peuvent être traités par des logiciels puissants qui reconstituent les objets en trois dimensions, quantifient leurs paramètres, ou modélise leurs relations topologiques.
III. Les applications
A. La technique FISH
C'est la technique clef de l'analyse moléculaire du noyau et des chromosomes à l'échelle microscopique. Cette technique fait appelle à une séquence d'ADN complémentaire de celle qui doit être détectée. Cette séquence est appelé SONDE. Elle est marqué par des nucléotides couplés à un fluorochrome ou à une molécule antigénique (comme la Digoxigénine-dUTP) qui sera révélée par un anticorps fluorescent (anti-Dig). Les sondes sont principalement de trois types :
A.1. Les sondes de loci : détectant des séquence d'ADN spécifiques (génique ou non génique). Elles ont une taille de quelques milliers ou dizaines de milliers de nucléotides et sont clonées dans des vecteurs de types Chromosomes Artificiels de la Levure ou YAC (Yeast Artificial Chromosomes). Elles produisent des signaux punctiformes.
A.2. Les sondes centromériques : qui détectent les séquences répétées dites "alphaé spécifiques de chaque centromère. Elles sont utilisées pour dénombrer les chromosomes et étudier leurs positions respectives dans le noyau
A.3. Les sondes chromosomiques : correspondent à la totalité de l'ADN de chaque chromosome sur lequel elles se fixent et dont elles marquent les bras courts et longs ("peinture chromosomique"). Elles sont produites à partir de chromosomes purifiés par Cytométrie de Flux. La molécule d'ADN de plusieurs millions de nucléotides est coupée en fragments qui sont marqués. Il est possible de réaliser une hybridation avec une solution contenant les sondes de tous les chromosomes, marquées avec des fluorochromes distincts. Les spectres des signaux d'hybridation seront ensuite traités par un logiciel qui assignera à chaque chromosome une "fausse" couleur ("caryotype spectral").
La technique est réalisée relativement simplement en mettant en présence les cellules ou les chromosomes fixés sur lame (par une solution d'alcool-acide acétique par exemple) et quelques ng de sondes dans 100 µg de tampon d'hybridation, après dénaturation par la chaleur. Après une nuit d'hybridation et lavage, les lames sont lues en lumière UV, l'image peut être digitalisée et traitée par des logiciels d'analyse d'images.
B. Le "photo-blanchissage" (photobleaching)
C'est une technique permettant
l'étude de la dynamique des molécules et compartiments
cellulaires, dont la chromatine et les protéines nucléaires.
Des cellules vivantes ayant été marquées par l'une des
méthodes décrites (nucléotides fluorescente ou GFP) sont
illuminées de façon intense par le laser du microscope sur une
région très limitée, qui éteint la fluorescence (zone
"blanchie"). La cellule est alors observée pendant plusieurs
heures. Si le compartiment est statique la zone reste
"blanche". Si le compartiment est dynamique de nouvelles
molécules viennent occuper la zone e restaurent la
fluorescence. On peut ainsi calculer des vitesses et évaluer
le type de mouvement des molécules, diffusion, diffusion
contrainte, mouvements actifs...
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