description
Biologie cellulaire
Membrane plasmique Transports membranaire Processus de reconnaissance et d'adhesion intercellulaire Matrice extracellulaire
Cytosquelette Reticulum endoplasmique Appareil de golgi Lysosomes
Peroxysomes Devenir des proteines cellulaires Communications et signaux intercellulaires Mitochondries

 

Biologie moléculaire
Techniques d'etude de l'architecture du noyau Chromatine Noyau interphasique Organisation moleculaire du genome
Genes Enveloppe et pore nucleaire Replication de l'A.D.N. des cellules eucaryotes Transcription chez les eucaryotes
Cycle cellulaire Apoptose / Necrose Theorie cellulaire procaryotes et eucaryotes  

 

Réplication de l'ADN des cellules eucaryotes

 

 

   I. Caractéristique de la réplication

La réplication de l'ADN est :

      A. Semi-conservative : Chaque molécule d'ADN répliquée est constituée de deux brins, dont l'un (le brin matrice) provient de la molécule mère, et l'autre (le brin néo-formé, complémentaire du brin matrice) est synthétisé au cours de la réplication.

      B. Bicaténaire et asymétrique : Les deux brins sont répliqués simultanément. Toutefois l'allongement de la chaîne polynucléotidique ne peut se faire que dans le sens 5'>3'en raison des caractéristiques des ADN Polymérases. Le brin de polarité 3'>5' sera dont répliqué par une chaîne continue (brin direct ou précoce), alors que le brin 5'>3' sera répliqué de façon discontinue, par de courts fragments (fragments d'Okazaki, de 100 à 200 nucléotides) synthétisés dans un sens rétrograde et secondairement réunis (brin indirect ou retardé).

      C. Hiérachisée : La réplication de l'ADN se déroule au cours de la phase S, qui dure environ 6 à 7 heures dans les cellules humaines. Au cours de la phase S les origines de réplication sont activées selon une chronologie qui dépend de la composition de l'ADN, du contenu génique des régions du génome, de leur localisation nucléaire et de leur niveau de condensation (revoir les notions d'isochores de bandes chromosomiques, et d'hétérochromatine).

      D. Bidirectionnelle : Au niveau de chaque site d'initiation de la réplication, deux complexes de réplication sont simultanément activés sur chacun des brins de la molécule mère. Ces complexes progressent dans les deux directions, formant des «bulles» de réplication qui convergent et dont la coalescence marque la fin de la synthèse des molécules d'ADN sous l'effet de contraintes topologiques.

Chez l'homme il existe environ 20 000 origines de réplication (OR) réparties le long de la molécule d'ADN tous les 150 kb. Chez les eucaryotes la vitesse de réplication est de 50 nucléotides- par seconde dans les deux directions, soient 100 nucléotides/sec.

   II. Le processus de la réplication

La réplication débute par la fixation sur les OR du complexe de réplication appelé réplisome. Cette fixation dépend des séquences des OR reconnues par des protéines accessoires qui recrutent le réplisome au site d'initiation. Les OR pourraient correspondre à des domaines de plusieurs centaines ou milliers de nucléotides comprenant des séquences riches en adénine et thymine. Une séquence formée de couples AT liés par deux liaisons hydrogènes permet une dissociation plus facile des deux brins d'ADN que les séquences GC (trois liaisons hydrogène). Les OR sont activées séquentiellement par groupes de quelques dizaines formant des « foyers de réplication»

 

   III. Réplication des télomères

L'extrémité' des chromosomes est constituee par une structure complexe associant séquences d'ADN répétées et protéines, qui joue un rôle fondamental dans le maintien de la stabilité du génome. Cette structuré est appelée télomère. En l'absence de télomères les extrémités chromosomiques fusionnent, provoquant cassures des chromatides, aneuploïdie, et déstabilisation du génome aboutissant à la mort cellulaire.
Chez les vertébrés le motif télomérique unitaire TT AGGG est répété plusieurs milliers de fois pour former une séquence de 10-12 kb dans les cellules de nouveaux nés humains.
Lors de la réplication de l'ADN, la lacune produite- par la dégradation de la première amorce initiant le premier fragment d'Okazaki sur le brin retardé ne peut être comblé, le réplisome progressant dans le sens 5'-3'. Il persiste donc un segment monocaténaire aux extrémités de chaque chromosome en fin de phase S, dont la longueur est celle d'une amorce d'ARN (quelques dizaines de nucléotides). Cette structure anormale est détectée par les systèmes de surveillance du génome, et les extrémités des chromosomes sont arasées ce qui provoque un raccourcissement des télomères de 50 à 200 pb à chaque réplication. Ce phénomène rend compte du raccourcissement progressif des télomères en fonction du nombre de divisions cellulaires. Chez l'homme la longueur des télomères les plus courts dans certaines cellules de sujets octogénaires est de l'ordre de 4 à 6 kb.
Le raccourcissement progressif des télomères pourrait être utilisé par les cellules pour mesurer le nombre de divisions effectuées, normalement 50 à 60 au cours de la vie d'un individu. Au-delà d'une taille minimum critique la réplication devient impossible (<< sénescence réplicative»), et la cellule évolue éventuellement vers la mort programmée ou apoptose. Toutefois les mécanismes de cette « horloge mitotique» restent très mal connus. Intervient sans doute le système p53 appelé « gardien du génome».
Une enzyme à activité de transcriptase inverse est capable de répliquer l'extrémité des télomères, indépendamment du réplisome et sans utiliser le brin parental comme matrice. Cette enzyme appelée télomérase est constituée de deux sous unités. Un ARN complémentaire de la séquence TT AGGG utilisé comme matrice (TERC ou Telomerase RNA Component), et une sous-unité enzymatique qui assure la synthèse de la séquence télomérique (TERT ou Telomerase Reverse Transcriptase). La TERC est présente dans la plupart des cellules. Par contre la TERT est absente de la presque totalité des cellules somatiques. Elle n'est exprimée que par les cellules-embryonnaires, les cellules germinales et certaines cellules somatiques à renouvellement rapide comme les cellules de la moelle osseuse, les cellules immunitaires et les cellules souches des cryptes intestinales. La TERT joue donc un rôle clef dans le contrôle de la capacité réplicative des cellules, et sa répression est cruciale pour bloquer une prolifération anormale et permettre la sénescence réplicative.
En accord avec cette fonction, l'expression forcée du gène de la TERT dans des cellules en culture provoque leur immortalisation.
Plus importante est la découverte que la réexpression du gène de la TERT par les cellules cancéreuses est un mécanisme précoce du développement des tumeurs. La TERT représente donc une cible thérapeutique potentielle et la mesure de son expression peut être utilisée pour la détection des cellules malignes.

 

   IV. Correction post-réplicative

La Pol δ introduit des nucléotides fautifs selon une fréquence de 10-5. L'élimination de ces nucléotides par sa fonction de correction sur épreuve est prise en défaut avec une fréquence de 10.2. En fin de phase S subsiste donc un taux d'erreur de 10.7, soit en moyenne 600 nucléotides par génome humain diploïde.
Ces erreurs sont corrigées par un système de correction post-réplicative (CPR) des mésappariements qui laisse persister des nucléotides fautifs avec une fréquence 10-3. Le taux final des mutations en fin de 5 après intervention des deux systèmes de correction est donc de 10.1°.
La CPR met en jeu chez l'homme une dizaine de protéines homologues de celles initialement caractérisées chez les bactéries et la levure.
Chez E. Coli ces protéines sont MutS, MutL et Mut H. Il existe chez l'homme 5 homologues de MutS appelés MSH (2,3,4,5,et 6) et 4 homologues de MutL appelés MLH (1,2,3) et PMS1. Alors que les protéines bactériennes agissent à l'état monomérique, les homologues humains forment d'hétérodimères (qui seront indiqués entre parenthèses dans la description qui suit).
Le mésappariement (par exemple TT ou GT) provoque une distorsion de la double hélice reconnue par MutS (MSH2/MHS3 et MSH2/MSH6) qui promeut le formation d'une boucle. Secondairement se fixe sur cette boucle la protéine MutL (MLH1/PMS2) qui coordonne la fixation des autres protéines intervenant dans l'élimination et la correction du mésappariement. Chez E. Coli MutH est une endonucléase qui initie la coupure du brin néoformé contenant l'erreur de réplication. Il n'existe pas d'homologue humain de MutH.
L'excision du fragment contenant le mésappariement par des exo et endonucléases est suivie par une étape de synthèse de l'ADN par la Polo et les protéines associées (PCNA, RPA ...).
Le CPR est impliqué dans les mécanismes de cancérisation. Un défaut de
, réparation secondaire à une mutation ou à un déficit des protéines impliquées provoque l'accumulation de mésappariements qui sont secondairement fixés sous forme de mutations (les cellules acquièrent un « phénotype mutateur ») qui peuvent altérer la fonction de nombreux gènes clefs de la prolifération et de la différentiation.
Ce mécanisme se traduit par un phénomène caractéristique: l'instabilité des microsatellites. Les séquences microsat (mono ou di nucléotides) sont particulièrement sujettes à des erreurs de réplication par « glissement» de la Pol qui provoquent des microdélétions et des microinsertions (voir le schéma dans le cours sur l'Anatomie moléculaire du génome). La détection par PCR de cette instabilité des microsat est utilisée pour identifier la présence d'un défaut du système de CPR.
L'acquisition d'un phénotype mutateur par inactivation des gènes CPR fait partie de la multitude des évènements qui jalonnent le développement d'un cancer. Mais des mutations des homologues humains des gènes Mut peuvent également être transmise par voie germinale des parents aux enfants déterminant une susceptibilité héréditaire a~ cancers. C'est le cas de certaines formes de cancers familiaux du colon dus à des mutations de MSH2 et MLH1.